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　　《國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)示范中心配套教材：微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》共分八章，第一章介紹微生物的個(gè)體形態(tài)觀察；第二章為微生物的分離和純培養(yǎng)；第三章為微生物的生長(zhǎng)和數(shù) 量的測(cè)定；第四章為微生物的生理生化反應(yīng)：第五章為微生物的遺傳與育種；第六章為細(xì)菌的血清學(xué)鑒定：第七章為分子微生物學(xué)基礎(chǔ)；第八章為應(yīng)用微生物學(xué)實(shí) 驗(yàn)，總計(jì)61個(gè)實(shí)驗(yàn)。最后為附錄，包括常用微生物名稱、常用培養(yǎng)基配方、常用試劑和溶液的配制、常用染色液和配制等。
　　《國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)示范中心配套教材：微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》為大學(xué)本科微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教材，供高等學(xué)校生物科學(xué)、生物技術(shù)、生物工程、發(fā)酵工程、植物科學(xué)和生產(chǎn)類各專業(yè)學(xué)生及科研、生產(chǎn)單位相關(guān)人員參考。

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第一章微生物的個(gè)體形態(tài)觀察
實(shí)驗(yàn)1 細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色及形態(tài)觀察
【實(shí)驗(yàn)原理】
細(xì)菌菌體微小且透明，在光學(xué)顯微鏡下，特別是在油鏡下，菌體與背景沒(méi)有顯著的明暗差，很難看清菌體形態(tài)。若菌體染色，則菌體折光率增大，其形態(tài)易于觀察。
細(xì)菌染色的染料是一類苯環(huán)上含有發(fā)色基團(tuán)和助色基團(tuán)的化合物。發(fā)色基團(tuán)使化合物具有染色能力；助色基團(tuán)有電離特性，可以與被染物結(jié)合，使被染物著色。染色的染料分為堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料帶正電荷，能和帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。因細(xì)菌蛋白的等電點(diǎn)較低，當(dāng)它生長(zhǎng)于中性、堿性或弱酸性的溶液中時(shí)常帶負(fù)電荷，所以通常采用美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等堿性染料使其著色。酸性染料帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加，易被伊紅、剛果紅或酸性復(fù)紅等酸性染料著色。中性染料又稱復(fù)合染料，是前兩類染料的結(jié)合物，如伊紅美藍(lán)、伊紅天青等。
簡(jiǎn)單染色法是利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色以顯示其形態(tài)的一種方法。
該方法操作簡(jiǎn)便，適于觀察細(xì)菌的一般形狀及排列，但不能辨別細(xì)菌細(xì)胞的構(gòu)造。
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵蟆?/span>
1.了解簡(jiǎn)單染色法的基本原理，并掌握其操作方法；
2.掌握油鏡的使用及無(wú)菌操作技術(shù)；
3.初步認(rèn)識(shí)細(xì)菌的形態(tài)特征。
【實(shí)驗(yàn)器材】
1.菌種大腸桿菌（Escherichiacoli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）。
2.染色液堿性美藍(lán)染液、結(jié)晶紫染液。
3.器材顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、香柏油、二甲苯、生理鹽水、擦鏡紙等。
【實(shí)驗(yàn)方法與步驟】
簡(jiǎn)單染色法的基本程序如下：涂片干燥固定染色水洗干燥鏡檢
1.涂片在干凈的載玻片中央滴加一小滴生理鹽水或用接種環(huán)挑3或4環(huán)生理鹽水，然后在無(wú)菌操作條件下，用接種環(huán)從斜面上挑取少量菌種于載玻片上的生理鹽水中，混勻并涂成薄膜，涂布面積為1～1.5cm2。
2.干燥涂片可以放在空氣中自然干燥；若要使干燥速度加快，可在酒精燈上方加溫，但勿緊靠火焰。
3.固定待涂片干燥后，手持涂片一端，有菌膜的一面向上，在酒精燈火焰上通過(guò)2或3次，待冷卻后，再加染料。
4.染色將涂片水平放置，在菌膜部位滴加染色液（以恰好覆蓋菌膜為宜），染色1～2min。
5.水洗傾去染液，斜置涂片，用細(xì)水流的自來(lái)水沖洗（切勿用自來(lái)水直接沖洗菌膜部位），直至洗下水呈無(wú)色為止。
6.干燥將水洗的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干，注意不要擦撩菌體。
7.鏡檢待涂片干燥后，先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察，找出適當(dāng)?shù)囊曇昂�，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在菌膜部位上加香柏油一滴，然后將油鏡頭浸入油滴中仔細(xì)調(diào)焦觀察細(xì)菌的形態(tài)。鏡檢完成后，用擦鏡紙滴加二甲苯1～2滴，擦干凈油鏡鏡頭上殘留的香柏油，保持鏡頭的干凈。
【結(jié)果與分析】
繪制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌體形態(tài)圖。
【注意事項(xiàng)】
1.涂片時(shí)，生理鹽水及菌體不宜過(guò)多，涂片要均勻，不宜過(guò)厚。
2.水洗時(shí)，水流不宜過(guò)大、過(guò)急，以免涂片薄膜脫落。
3.熱固定時(shí)溫度不宜過(guò)高（以玻片背面不燙手為宜），否則會(huì)改變甚至破壞細(xì)胞形態(tài)。
【思考題】
1.為什么染色前需要進(jìn)行菌體固定？
2.為什么固定時(shí)只能微加熱？若加熱溫度過(guò)高、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)什么問(wèn)題？
3.為什么要待涂片完全干燥后才能使用油鏡進(jìn)行觀察?
4.為什么鏡檢完成后必須清除殘留在油鏡鏡頭上的香柏油？
實(shí)驗(yàn)2細(xì)菌的革蘭氏染色法
【實(shí)驗(yàn)原理】
革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的一個(gè)重要特征，它是1884年由丹麥醫(yī)生C.Gram創(chuàng)立的。革蘭氏染色法（Gramstain）不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)，而且還可將細(xì)菌分為染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的革蘭氏陽(yáng)性（G+）菌，染色反應(yīng)呈紅色的革蘭氏陰性（G?）菌。細(xì)菌對(duì)于革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過(guò)程中，當(dāng)用乙醇處理時(shí)，由脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保留在細(xì)胞內(nèi)而不易脫色，因此，呈現(xiàn)藍(lán)紫色；革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處理時(shí)，脂類物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復(fù)染液（番紅）的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵蟆?/span>
1.了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性；
2.掌握革蘭氏染色方法。
【實(shí)驗(yàn)器材】
1.菌種培養(yǎng)18～24h的大腸桿菌（Escherichiacoli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）、待測(cè)菌一種。
2.藥品乙二酸銨結(jié)晶紫染液、盧戈氏（Lugol）碘液、95%乙醇、番紅復(fù)染液、無(wú)菌水。
3.用具載玻片、接種環(huán)、鑷子、酒精燈、火柴、洗瓶、廢液缸、吸水紙、顯微鏡等。
【實(shí)驗(yàn)方法與步驟】
1.涂片將培養(yǎng)18～24h的3種菌分別用接種環(huán)涂3條帶于清潔載玻片上（注意涂片不宜過(guò)厚），風(fēng)干、固定（通過(guò)火焰1或2次即可，不可過(guò)熱，以載玻片不燙手為宜）。
2.染色
（1）初染：滴加乙二酸銨結(jié)晶紫染液覆蓋涂菌帶，染色1～2min，水洗至洗出液無(wú)色。
（2）媒染：滴加盧戈氏碘液沖去殘水，并覆蓋約1.0min，水洗至洗出液無(wú)色。
（3）脫色：將載玻片上面的水用吸水紙吸干，在白色背景下滴加95%乙醇洗至洗出液無(wú)色時(shí)（20～30s），立即用水洗去乙醇，用吸水紙吸干。
（4）復(fù)染：用復(fù)染劑（番紅）染色10s，水洗。
（5）鏡檢：吸干或風(fēng)干后，油鏡觀察。
【結(jié)果與分析】
實(shí)驗(yàn)結(jié)果革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色。檢視實(shí)驗(yàn)中3種菌各染成什么顏色？它們是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽(yáng)性菌？將實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄在表2-1中。
【注意事項(xiàng)】
1.染液要求新配制，放置時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，盧戈氏碘液易褪色失效，必須裝在棕色試劑瓶?jī)?nèi)并放于暗處保存。
2.革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握95%乙醇脫色程度，如脫色過(guò)度，則陽(yáng)性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時(shí)，陰性菌可被誤染為陽(yáng)性菌，因此脫色時(shí)間一定要把握好。
3.菌齡也影響染色結(jié)果，如陽(yáng)性菌培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或已死亡及部分菌已自行溶解，都常呈陰性反應(yīng)，因此一定要確保實(shí)驗(yàn)菌的菌齡。
【思考題】
1.革蘭氏染色中涂片為什么不宜過(guò)厚？染色成敗的關(guān)鍵步驟是哪一步？
2.對(duì)未知菌種進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，如何保證染色技術(shù)操作正確、結(jié)果可靠？
實(shí)驗(yàn)3細(xì)菌的芽孢染色
【實(shí)驗(yàn)原理】
芽孢為某些細(xì)菌細(xì)胞在不良的環(huán)境條件下產(chǎn)生的休眠體，芽孢壁厚、透性低、不易著色，而一旦染上顏色以后難以脫色。
芽孢染色主要是利用不同的染料進(jìn)行染色，使芽孢和營(yíng)養(yǎng)體呈不同的顏色。
在加熱條件下，用著色力強(qiáng)的染料對(duì)芽孢進(jìn)行染色，菌體也會(huì)著色，然后水洗，芽孢染上的顏色難以被洗脫，而菌體會(huì)脫色。然后用對(duì)比度大的復(fù)染劑對(duì)菌體染色，菌體染上復(fù)染劑顏色，芽孢仍為原來(lái)的顏色，因而能更明顯地襯托出芽孢，便于觀察。
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵蟆?/span>
1.學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌的芽孢染色法；
2.了解并觀察細(xì)菌芽孢的結(jié)構(gòu)和形態(tài)。
【實(shí)驗(yàn)器材】
1.菌種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、生孢梭菌（Clostridium sporogenes），在適宜的生長(zhǎng)溫度下培養(yǎng)20h。
2.藥品5%孔雀綠水溶液、0.5%番紅水溶液、二甲苯、香柏油、蒸餾水、95%乙醇。
3.用具顯微鏡、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、擦鏡紙、吸水紙等。
【實(shí)驗(yàn)方法與步驟】
1.制片取清潔載玻片，在中央滴一滴蒸餾水，用接種環(huán)無(wú)菌操作從枯草芽孢桿菌斜面上挑一環(huán)菌置于載玻片液滴上，小液滴呈混濁狀即可，并按常規(guī)方法干燥、固定（每隔幾秒在酒精燈火焰上過(guò)一次）。
2.加熱染色往載玻片滴加數(shù)滴5%孔雀綠水溶液覆蓋涂菌部位，用夾子夾住載玻片在微火上加熱至染液冒蒸汽（此時(shí)計(jì)時(shí)）并維持5.0min，加熱時(shí)注意補(bǔ)充染液，勿讓涂片干涸。
3.脫色待玻片冷卻后，用緩流自來(lái)水沖洗至流出水無(wú)色為止。
4.復(fù)染用0.5%的番紅水溶液復(fù)染1.5～2.0min。
5.水洗用緩流自來(lái)水沖洗至流出水無(wú)色為止。
6.鏡檢待載玻片自然干燥后（可在酒精燈火焰上每隔幾秒過(guò)一次）油鏡鏡檢，觀察芽孢的形態(tài)。
【結(jié)果與分析】
按表3-1記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【注意事項(xiàng)】
1.芽孢染色用的菌種應(yīng)控制菌齡，幼齡菌尚未形成芽孢，老齡菌芽孢囊破裂。
2.從試管中取菌液時(shí)，應(yīng)先用接種環(huán)充分?jǐn)嚢瑁缓笤偬羧【�，否則菌體沉于管底，涂片時(shí)菌體太少。
3.對(duì)芽孢進(jìn)行孔雀綠染色后，一定要等玻片冷卻后方可用水沖洗。
【思考題】
1.芽孢染色法為什么需要加熱？加熱染色時(shí)為什么必須維持在染液微冒蒸汽的狀態(tài)？
2.脫色反應(yīng)中，為什么必須用緩流自來(lái)水沖洗？
實(shí)驗(yàn)4細(xì)菌的鞭毛染色及運(yùn)動(dòng)性觀察
【實(shí)驗(yàn)原理】
鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)“器官”，細(xì)菌是否具有鞭毛，以及鞭毛著生位置和數(shù)目是細(xì)菌分類鑒定的重要依據(jù)之一。細(xì)菌的鞭毛一般都很纖細(xì)，其直徑通常為10～20nm，除了很少數(shù)能形成鞭毛束（由許多根鞭毛構(gòu)成）的細(xì)菌可以用相差顯微鏡直接觀察到鞭毛束的存在外，細(xì)菌的鞭毛一般均不能用光學(xué)顯微鏡直接觀察到，而只能用電子顯微鏡觀察。光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌鞭毛，必須用鞭毛染色法。
鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染劑處理，使它沉積在鞭毛上，從而使鞭毛直徑加粗，然后再進(jìn)行染色。常用的媒染劑由單寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成。本實(shí)驗(yàn)主要介紹硝酸銀染色法和改良的Leifson染色法，前一種方法更容易掌握，但染色劑配制后保存期較短。
在顯微鏡下觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性，可以初步判斷細(xì)菌是否具有鞭毛。通常使用壓滴法或懸滴法觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性。與鞭毛染色法相比，該方法可以較快速、簡(jiǎn)便地判斷細(xì)菌是否具有鞭毛。觀察時(shí)，要適當(dāng)減弱光強(qiáng)度以增強(qiáng)反差，若光線太強(qiáng)，細(xì)菌和周圍的液體難以區(qū)分。

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