實驗10-16 高效液相色譜法測定食品中蘇丹紅

　　一、預(yù)習(xí)要點
　　1. 固相萃取樣品預(yù)處理方法的原理和操作要點；
　　2. 梯度洗脫的特點。
　　二、實驗?zāi)康?br />　　1. 了解梯度洗脫的特點和梯度洗脫條件的設(shè)定方法；
　　2. 學(xué)習(xí)固相萃取樣品預(yù)處理方法；
　　3. 學(xué)習(xí)高效液相色譜測定食品中的蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ的原理和實驗方法。
　　三、實驗原理
　　蘇丹紅為人工合成的一類偶氮類工業(yè)染料，主要應(yīng)用于溶劑、蠟染、增光等方面，由于其成本低廉，顏色鮮艷，不易褪色，不少不法商販將蘇丹紅添加到雞鴨飼料以及辣椒制品等食品中去，極大地危害了消費者的健康。研究表明，蘇丹紅的原型和代謝產(chǎn)物均有潛在致癌作用，已被禁止作為食品添加劑使用。目前已報道食品中蘇丹紅的檢測方法有液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、氣質(zhì)聯(lián)用法等。
　　本實驗采用高效液相色譜法測定食品中蘇丹紅的含量。樣品經(jīng)溶劑提取、固相萃取凈化后，用反相高效液相色譜-紫外可見光檢測器進(jìn)行檢測，梯度洗脫，采用外標(biāo)法定量。
　　四、儀器與試劑
　　1.儀器
　　高效液相色譜儀（配有紫外可見分光光度檢測器）；分析天平：感量0.1 mg；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；均質(zhì)機；離心機；0.45 μm有機濾膜；層析柱管：1 cm（內(nèi)徑）×5 cm(高)的注射器管。
　　2．試劑
　　乙腈、丙酮，均為色譜純；甲酸、乙醚、正己烷、無水硫酸鈉，均為分析純。
　　層析用氧化鋁（中性，100~200目）：105 ℃干燥2 h，于干燥器中冷至室溫，每100 g中加入2 mL水，混勻后密封，放置12 h后使用。
　　5%丙酮的正己烷液：吸取50 mL丙酮，用正己烷定容至1 L；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅III、蘇丹紅IV，純度≥95%；標(biāo)準(zhǔn)貯備液：分別稱取蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅III及蘇丹紅IV各10.0 mg（按實際含量折算），用乙醚溶解后，用正己烷定容至250 mL。
　　五、實驗步驟
　　1．氧化鋁層析柱的制備：在層析柱管底部塞入一薄層脫脂棉，干法裝入處理過的氧化鋁至3 cm高，輕敲實后加一薄層脫脂棉，用10 mL正己烷預(yù)淋洗，洗凈柱中雜質(zhì)后，備用。
　　2．樣品處理
　�。�1）紅辣椒粉等粉狀樣品
　　稱取1~5 g紅辣椒粉（準(zhǔn)確至0.001 g）于錐形瓶中，加入10~30 mL正己烷，超聲5 min，過濾，用10 mL正己烷洗滌殘渣數(shù)次，至洗出液無色，合并正己烷液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 mL以下，慢慢加入氧化鋁層析柱中，為保證層析效果，在柱中保持正己烷液面為2 mm左右時上樣，在全程的層析過程中不應(yīng)使柱干固涸，用正己烷少量多次淋洗濃縮瓶，一并注入層析柱�？刂蒲趸�鋁表層吸附的色素帶寬宜小于0.5 cm，待樣液完全流出后，視樣品中含油類雜質(zhì)的多少，用10~30 mL正己烷洗柱，直至流出液無色，棄去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己烷液60 mL洗脫，收集、濃縮后，用丙酮轉(zhuǎn)移并定容至5 mL，經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾后待測。
　�。�2）辣椒醬、番茄沙司等含水量較大的樣品
　　稱取10~20 g（準(zhǔn)確至0.01 g）樣品于離心管中，加10~20 mL水將其分散成糊狀，含增稠劑的樣品多加水，加入30 mL正己烷：丙酮=3：1，勻漿5 min，3000 rmin-1離心10 min，吸出正己烷層，于下層再加入20 mL×2次正己烷，勻漿，離心，合并3次正己烷，加入無水硫酸鈉5.0 g脫水，過濾后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干并保持5 min，用5 mL正己烷溶解殘渣后，按(1)中“慢慢加入氧化鋁層析柱過濾后待測”操作。
　　（3）香腸等肉制品
　　稱取粉碎樣品10~20 g（準(zhǔn)確至0.01 g）于錐形瓶中，加入60 mL正己烷充分勻漿5 min，濾出清液，再以20 mL×2次正己烷勻漿，過濾。合并3次濾液，加入5 g無水硫酸鈉脫水，過濾后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸至5 mL以下，按步驟（1）中“慢慢加入氧化鋁層析柱中…過濾后待測”操作。
　　3. 檢測
　�。�1）配制標(biāo)準(zhǔn)溶液
　　用移液管分別吸取蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.6 mL，用正己烷定容至25 mL，此標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為0.00 μgmL-1、0.16 μgmL-1、0.32 μgmL-1、0.64 μgmL-1、1.28 μgmL-1、2.56 μgmL-1。
　�。�2）在教師的指導(dǎo)下開啟液相色譜儀，設(shè)定操作條件。色譜柱：Zorbax SB-C18 (150×4.6 mm i.d., 3. 5 μm)；流動相：溶劑A，0.1%甲酸的水溶液：乙腈=85：15（體積比）;溶劑B， 0.1%甲酸的乙腈溶液：丙酮=80：20（體積比）；梯度洗脫條件見表10-1；流速：1 mLmin-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：蘇丹紅Ⅰ478 nm；蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅III、蘇丹紅IV 520 nm，于蘇丹紅Ⅰ出峰后切換。進(jìn)樣量10 μL。
　　表10-1 梯度洗脫條件
　　時間/ min 流動相/% 曲線
　　A B
　　0 25 75 線形
　　10.0 25 75 線形
　　25.0 0 100 線形
　　32.0 0 100 線形
　　35.0 25 75 線形
　　40.0 25 75 線形

　�。�3）待儀器穩(wěn)定后，按標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度遞增的順序，由稀到濃依次等體積進(jìn)樣10 μL（每個標(biāo)樣重復(fù)進(jìn)樣3次），準(zhǔn)確記錄各自的保留時間。
　�。�4）同樣取10 μL待測樣品進(jìn)行色譜分析。
　�。�5）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物的保留時間確定樣品中的蘇丹紅組分峰。
　�。�6）計算系列標(biāo)準(zhǔn)物和樣品的峰面積。
　�。�7）以標(biāo)準(zhǔn)物的峰面積對相應(yīng)濃度做工作曲線。
　�。�8）從工作曲線上求得樣品中蘇丹紅的濃度。
　　六、數(shù)據(jù)處理
　　按如下公式（10-3）計算蘇丹紅含量
　　R = C V M （10-3）
　　式中 R—樣品中蘇丹紅含量， mgkg-1；
　　C—由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的樣液中蘇丹紅的濃度， μgmL-1；
　　V—樣液定容體積， mL；
　　M—樣品質(zhì)量， g。
　　七．注意事項
　　1. 不同廠家和不同批號氧化鋁的活度有差異，須根據(jù)具體購置的氧化鋁產(chǎn)品略作調(diào)整，活度的調(diào)整采用標(biāo)準(zhǔn)溶液過柱，將1 μgmL-1 的蘇丹紅的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL 加到柱中，用5%丙酮正己烷溶液60 mL完全洗脫為準(zhǔn)，4種蘇丹紅在層析柱上的流出順序為蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅳ、蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅III，可根據(jù)每種蘇丹紅的回收率作出判斷。蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅳ的回收率較低，則表明氧化鋁活性偏低；蘇丹紅III的回收率偏低，則表明氧化鋁活性偏高。
　　2. 用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止溶劑混合時產(chǎn)生氣泡。
　　3. 每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始的狀態(tài)。需讓10-30倍柱容積的初始流動相流經(jīng)色譜柱，使固定相和初始流動相達(dá)到完全平衡。
　　八、思考題
　　1. 如何提高分析的精確度？等度洗脫和梯度洗脫有何區(qū)別？
　　2. 梯度洗脫時應(yīng)注意哪些問題？
　　九、參考文獻(xiàn)
　　[1] 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GBT 19681—2005.食品中蘇丹紅染料的檢測方法.高效液相色譜法.
　　[2] 孫姝琦,田毅敏,杜振霞.超高效液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析番茄醬中蘇丹紅Ⅰ-Ⅳ含量.分析測試學(xué)報, 2007,(26 ) :225.
　　[3] 嚴(yán)拯宇主編.分析化學(xué)實驗與指導(dǎo), **版, 中國醫(yī)藥科技出版社 2005：189.
　　[4] 潘志明,李忠,王冰,周路明.食品中蘇丹紅檢測研究進(jìn)展.世界科技研究與發(fā)展, 2007,29(6 ):14.
　　[5] 武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院實驗中心編. **版. 儀器分析實驗.2005: 86-87.