第一章轉(zhuǎn)基因技術(shù)概述
　　在自然界，生命的種類繁多且復(fù)雜。盡管生命的遺傳性狀在不同種類或同種不同個體間是有差異的，但相對穩(wěn)定。在特定的條件下，遺傳性狀可因突變、基因轉(zhuǎn)移（genetransfer）等而發(fā)生不同程度的改變。基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象在自然界的生物體中非常常見。在原核細(xì)胞型微生物，基因的轉(zhuǎn)移常采用轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、溶源性轉(zhuǎn)換和原生質(zhì)體融合等方式進行，可賦予受體生物新的生物學(xué)性狀，如形態(tài)結(jié)構(gòu)、耐藥性、毒力和抗原性等的改變。而在非細(xì)胞型微生物，如病毒，可發(fā)生病毒基因組之間的重組和重配，或基因產(chǎn)物的互補和表型混合等；此外，部分腫瘤相關(guān)病毒的基因組可以整合到病毒感染的宿主細(xì)胞染色體中，造成宿主細(xì)胞基因組發(fā)生變異，甚至惡性轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基因技術(shù)，就是基于自然界中常見的基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，人為地加以利用，用于不同生命體之間基因轉(zhuǎn)移，尤其是將外源基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞，用以研究生命科學(xué)的基本現(xiàn)象和機制、基因工程產(chǎn)品制備、基因治療、疾病預(yù)防和動物模型制備等，為人類的健康事業(yè)做出貢獻。
　　一、常見的基因轉(zhuǎn)移方式
　�。ㄒ唬┺D(zhuǎn)化
　　早在1928年，F(xiàn)rederick在研究肺炎鏈球菌時，昀先報道了細(xì)菌的轉(zhuǎn)化（transformation）現(xiàn)象。將有莢膜的、菌落呈光滑（S）型的Ⅲ型肺炎鏈球菌注射至小鼠體內(nèi)，小鼠死亡，從死鼠血中可分離到Ⅲ型肺炎鏈球菌。將無莢膜的、菌落呈粗糙（R）型的Ⅱ型肺炎鏈球菌，或?qū)ⅱ骃型菌加熱殺死后再注射小鼠，則小鼠存活。但如將熱殺死的ⅢS型菌與活的ⅡR型菌混合在一起注射小鼠，則小鼠死亡，并從死鼠血中分離出活的ⅢS型菌。這表明活的ⅡR型菌從死的ⅢS型菌中獲得了產(chǎn)生ⅢS型菌莢膜的遺傳物質(zhì)，使活的ⅡR型菌轉(zhuǎn)化為ⅢS型菌。1944年，Avery等用提取的ⅢS型菌的DNA片段代替熱殺死的ⅢS型菌，與活的ⅡR型菌一起注射小鼠，仍導(dǎo)致小鼠死亡，且從死鼠血中分離到ⅢS型菌。終于證實引起ⅡR型菌轉(zhuǎn)化的物質(zhì)是ⅢS型菌的DNA。這就是著名的小鼠體內(nèi)肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實驗。
　　現(xiàn)在，轉(zhuǎn)化因此而被定義為：受體菌直接攝取供體菌游離的DNA片段，并將其整合到自己菌體基因中去，從而使受體菌獲得供體菌新的遺傳性狀的過程。轉(zhuǎn)化可以分為自然轉(zhuǎn)化和人工轉(zhuǎn)化兩種。自然轉(zhuǎn)化強調(diào)的是細(xì)菌只要處于感受態(tài)（competence）這一特殊的生理狀態(tài)，即可攝取外源的線性染色體DNA分子和質(zhì)粒。感受態(tài)的出現(xiàn)時間和持續(xù)時間因菌種而異。除肺炎鏈球菌外，其他細(xì)菌如流感嗜血桿菌、葡萄球菌和芽孢桿菌等均具有自然轉(zhuǎn)化的能力。人工轉(zhuǎn)化則是通過人為的方法，如低溫CaCl2法誘導(dǎo)細(xì)菌處于感受態(tài)，使細(xì)菌具有攝取DNA的能力，或電穿孔法人為地將DNA導(dǎo)入菌體內(nèi)，為不具有自然轉(zhuǎn)化能力的很多細(xì)菌提供了一條獲取外源DNA的途徑，并且也是目前基因工程的基礎(chǔ)技術(shù)之一。
　�。ǘ�）轉(zhuǎn)導(dǎo)
　　1951年，Joshua和Norton發(fā)現(xiàn)了噬菌體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方式——轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。用兩株具不同的多重營養(yǎng)缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌混合培養(yǎng)后，基本培養(yǎng)基上長出原養(yǎng)型菌落，證實了該菌中存在重組現(xiàn)象。繼續(xù)用Davis的“U”形管實驗證實這一過程是否需要細(xì)胞間的直接接觸�！癠”形管中間隔有濾板，只允許培養(yǎng)基通過而細(xì)菌不能通過。其兩臂裝入完全培養(yǎng)基，將兩株營養(yǎng)缺陷型菌株分別接種到“U”形管兩臂進行培養(yǎng)后，在供體和受體細(xì)菌不接觸的情況下，同樣出現(xiàn)原養(yǎng)型細(xì)菌。表明這一重組過程并不需要細(xì)菌的直接接觸。仔細(xì)檢查后發(fā)現(xiàn)所用的沙門氏菌LT22A是攜帶P22噬菌體的溶源性細(xì)菌，另一株是非溶源性細(xì)菌，因此可透過“U”形管濾板的應(yīng)該是P22噬菌體并進行著基因的傳遞。
　　現(xiàn)在，轉(zhuǎn)導(dǎo)被定義為以溫和噬菌體為媒介，將供體菌的DNA片段轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)，使受體菌獲得新的遺傳性狀的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌均可發(fā)生。依據(jù)噬菌體和宿主菌關(guān)系，可把噬菌體分為毒性噬菌體和溫和噬菌體。只有溫和噬菌體能介導(dǎo)細(xì)菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)。根據(jù)DNA片段涉及的范圍，轉(zhuǎn)導(dǎo)可分為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)兩種。普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)是指噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)供體菌染色體的任何部分到受體菌中；而局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)是指噬菌體只能攜帶前噬菌體整合在染色體兩側(cè)的基因片段到受體菌中。
　�。ㄈ�）轉(zhuǎn)染
　　通常，感染（infection）被定義為病原體通過自然的途徑進入動物或人體，突破宿主的防御機制并引起不同程度的病理過程。在感染涉及的病原體中，病毒是非常具有特征性的一類病原體，屬于非細(xì)胞型微生物，在自然界的分布非常廣泛，可在人、動物、植物、昆蟲、真菌和原核細(xì)胞型微生物中寄居并引起感染。病毒體積微小，結(jié)構(gòu)非常簡單，僅含一種類型的核酸，因此必須在活細(xì)胞內(nèi)寄生以完成其復(fù)制周期。利用病毒專一性活細(xì)胞寄生及部分病毒整合感染的特點，對病毒的基因組進行分子遺傳學(xué)改造，設(shè)計出基因工程病毒載體。這種利用病毒載體將外源基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的過程稱轉(zhuǎn)染（transfection），以便與病毒的自然感染過程相區(qū)別（圖1-1）。近年來，轉(zhuǎn)染的廣義概念是指外源基因通過非病毒載體轉(zhuǎn)基因技術(shù)（物理、化學(xué)方法）或病毒載體轉(zhuǎn)基因技術(shù)的方法進入真核細(xì)胞的過程。
　　二、基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的方法
　�。ㄒ唬┗�因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的影響因素
　　原核生物如細(xì)菌，為了防止外源DNA的入侵，其體內(nèi)的限制性內(nèi)切核酸酶會將外源DNA水解成不同的片段，而同時對自己的核酸相應(yīng)的酶切位點進行甲基化修飾，保護自己的基因不受自己酶的破壞，這就是細(xì)菌的限制-修飾系統(tǒng)（restriction-modificationsystem）。如果是質(zhì)粒參與的基因轉(zhuǎn)移，依據(jù)質(zhì)粒復(fù)制時對宿主的依賴程度，可分為窄宿主譜質(zhì)粒和寬宿主譜質(zhì)粒；兩種以上的質(zhì)粒在同一宿主中還存在相容性和不相容性的
　　圖1-1野生型病毒的自然感染、病毒載體轉(zhuǎn)染和質(zhì)粒經(jīng)化學(xué)法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染
　　問題，這些因素會影響質(zhì)粒在宿主菌中的穩(wěn)定性。外源基因進入受體菌，必須依賴RecA蛋白與受體細(xì)菌同源序列之間發(fā)生同源重組；或不依賴RecA蛋白和同源序列發(fā)生非同源重組，從而讓受體菌獲得新的遺傳性狀。
　　外源基因進入真核細(xì)胞的影響因素與上述原核生物有顯著差別。真核細(xì)胞具有不同的膜樣結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜將細(xì)胞與外環(huán)境隔離開來，只允許特定的物質(zhì)進行膜內(nèi)外的交換；細(xì)胞核膜將細(xì)胞核和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境隔離開來；細(xì)胞器膜將細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的不同功能空間隔離開來。因為外源基因的化學(xué)性質(zhì)是DNA，為大分子質(zhì)量的物質(zhì)，并且對核酸酶非常敏感。外源基因進入真核細(xì)胞，要突破三大障礙因素。首先是必須到達細(xì)胞膜的表面，其次是如何突破細(xì)胞膜進入細(xì)胞質(zhì)，昀后是如何進入細(xì)胞核并啟動外源基因的表達。理想的轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法必然包括以下幾個方面：能夠保護外源基因不被核酸酶降解、能輸送外源基因到達細(xì)胞膜表面、有利于外源基因跨過細(xì)胞膜并促進其進入細(xì)胞核。
　　（二）外源基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的類型和方法
　　外源基因進入真核細(xì)胞的類型包括質(zhì)粒型載體和病毒顆粒型載體兩類，后者即病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可分為假型病毒載體和重組型病毒載體兩種。
　　質(zhì)粒型載體是將外源基因克隆入含有真核細(xì)胞（病毒）復(fù)制子的真核細(xì)胞表達質(zhì)粒，既可在大腸桿菌中傳代，也能在允許真核細(xì)胞中以染色體外質(zhì)粒的形式復(fù)制和表達外源基因，但不會產(chǎn)生感染性病毒顆粒。對于這種類型的載體進入真核細(xì)胞，常用物理（表1-1）和化學(xué)的方法（表1-2）。
　　表1-1介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移常用的物理方法
　　物理方法原理材料DNA用量優(yōu)點缺點
　　傳統(tǒng)的針頭注射外力注射器高便宜、簡單，便于效率比較低應(yīng)用于臨床
　　顯微注射細(xì)胞內(nèi)注射DNA顯微鏡和顯微注低適用于細(xì)胞水平步驟煩瑣，不適用射針的研究，不易降解于臨床，專業(yè)技術(shù)要求高
　　粒子轟擊高壓氣體使微小不同的加速裝置低對靶組織有很高需要很多的設(shè)備和的載體加速的效率步驟
　　電穿孔電脈沖 電穿孔儀低高轉(zhuǎn)染效率未得到廣泛認(rèn)可
　　流體動力學(xué)流體動力學(xué)的力量特殊的注射器中等簡單易于使用、轉(zhuǎn)組織局限性染效率高
　　包裹微球膠囊化的微球包中等控制下投遞和釋放制備的質(zhì)量控制裹DNA
　　超聲超聲儀超聲超聲儀中等偏低安全、組織損傷小技術(shù)不斷發(fā)展、經(jīng)驗有限
　　表1-2介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移常用的化學(xué)方法
　　公司 產(chǎn)品組成
　　Amersham-BiosciencesCellPhecttransfectionKitCaPO4orDEAE-DextranBio-RadLabsCytoFecteneTransfectionReagentCationiclipidBDBiosciences-CLOMTECHCLONfectinTMCationiclipid
　　CalPhosTMCalciumphosphateCPGInc.GeneLimoTMTransfectionReagentPlusPolycationiclipids+lipidcompoundGeneLimoTMTransfectionReagentPolycationiclipids+lipidcompoundSuper
　　GeneTherapySystems GenePORTERTMDOPE+ProprietarycompoundsGenePORTERTM2ProprietarymaterialBoosterExpressTMReagentKitProprietarymaterialPGeneGripTMVector/TransfectionGenePORTER+plasmidvector
　　SystemsGlenResearchCytofectinGSCationiclipid
　　續(xù)表
　　公司產(chǎn)品組成
　　InvitrogenLipofectAMINE2000TMReagentPolycationiclipid
　　LipofectAMINEPLUSTMReagentPolycationiclipid（DOSPA：DOPE）
　　LipofECTIN.ReagentCationiclipid（DOSPA：DOPE）
　　TransfectionReagentOptimizationSystemLipofectAMINEPLUSTM+Lipofectin.+CellFectin.+DMRIE
　　CellFectin.ReagentCationiclipopolyamine
　　OligofectAMINETMReagentProprietary
　　InvivoGenLipoVecTMCationicphosphonolipids
　　LipoGenTMNon-liposomallipid
　　MBIFermentasExGen500Cationicpolymer
　　ExGen500invivodeliveryagentCationicpolymer
　　NovagenGeneJuiceTMTransfectionReagentProprietarypolyamine
　　PanVeraCorporationTransⅡ.-TKOReagentsPolyamine.
　　TransⅡ.-LT-1andLT-2Polyamine.
　　TransⅡ.ExpressTransfectionReagentPolyamine.
　　TransⅡ.PanPackPolyamine+cationiclipid.
　　TransⅡ.-InsectaCationiclipid.
　　TransⅡ.-293Polyamine.
　　TransⅡ.-KeratinocytePolyamine
　　PromegaTransFASTTMTransfectionReagentCationiclipid
　　TfxTM-10，-20，and-50ReagentsCationiclipid
　　TfxTMReagentsTransfectionTrioCationiclipid
　　Transfectam.ReagentCationiclipid
　　ProFection.MammalianTransfectionDEAE-Destranorcalciumphosphate
　　System
　　QbiogeneGeneSHUTTLETM-20and-40ReagentsPolycationiclipids
　　InvivoGeneSHUTTLETMReagentLiposome-mediatedDOTAP：Chol.
　　DuoFectTMReage

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